ELISA 的注意事項

（一）加樣

在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 4－5 次加樣。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定 量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規(guī)定配制。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。

（二）保溫

在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規(guī)定的要求，保溫容器是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡 溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。

（三）洗滌

洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物 質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐 溫，Tween）一類物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨 酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中zui為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。

洗滌如不*，特別在zui后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。

ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：

①吸干孔內(nèi)反應液；

②將洗滌液注滿板孔；

③放置 2 min，略作搖動；

④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。